简单易用的CARS超快光源

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基于固态激光器的简单易用的单箱相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜，省去了两台要求高度同步的掺钛蓝宝石激光器。 Heinz P. Huber，Sandra Zoppel，Ingo Rimke 在过去的十年间，基于非线性光学效应的多光子显微技术在提高显微成像对比度和分辨率方面日益得到重视。通过增加照明光源的强度，这些非线性效应提高了图像的横向和纵向分辨率，实现了微尺度范围内的三维成像。在诸多多光子成像技术中，双光子激发荧光显微镜被广为采用，每年至少要安装几百套基于该技术的系统。[1]双光子成像使用同时吸收两个光子的办法来激发一个染料分子，其目的是获得跟激发波长相比具有蓝移的荧光。 可调谐飞秒激光被用作双光子激发的光源。通过共焦显微镜，荧光信号可以很容易地从激发背景中探测到，在现代生命科学中利用特定的染料分子，几乎可以看到所有的生理过程。 然而，双光子荧光显微镜的最大缺点是使用染料来成像，因为它们的毒性会改变机体内的生理过程。荧光蛋白质（如绿荧光蛋白）经常被用来代替染料，但是这种方法涉及复杂的基因样本复制技术。此外，这些染料在数分钟内被漂白的特性，将使荧光信号逐渐减弱。 基于非线性光学效应的一些方法被用于克服与染料相关的问题，这些效应包括二次或三次谐波产生（SHG或THG）、拉曼散射，或是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。CARS是一个涉及四个光子的三阶非线性效应（X(3)过程）。 在CARS过程中，频率为ωp的泵浦光和频率为ωs的斯托克斯光把样品激发到一个虚态（virtual state），并产生频率为ωp-ωs的分子振动。如果ωp-ωs等于分子的特征拉曼频率Ω，这种振动激发就会非常有效。通过三阶非线性过程产生的频率为ωas = (ωp-ωs) + ωp的反斯托克斯边带是最终的测量信号（见图1）。通过主动驱动振荡和相干作用，CARS信号会远远高于普通的拉曼散射。 图1：在CARS方案中，泵浦脉冲（ωp）和斯托克斯脉冲（ωs）产生了信号频率（ωas）。使用CARS进行成像可以获得相同的对比度而不需要使用染料，产生较强的频率为ωas的蓝移信号，可以很容易地从激发背景中区分和探测（见图2）。CARS信号对样品的振动模敏感，可以对活体内的分子振动密度成像。 图2：CARS显微镜捕获的线虫（上图）和活酵母细胞（下图）展示了高对比度和较高的图像质量，这也证明了这种技术的可行性。在线虫图像里，可以清楚地看到肠道和受精卵。肠道中血脂在2845cm-1产生很强的CARS信号（积分时间为5s）。活酵母细胞在2845cm-1共振处被记录（积分时间是1s）。两幅图的尺寸都是150×150